reaksi uji protein

R E A K S I  U J I  P R O T E I N

      I.            Tujuan Percobaan

Memahami proses uji adanya protein (identifikasi protein) secara kualitatif.

   II.            Teori Dasar

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Disamping berat molekul yang berbeda –beda, protein mempunyai sifat yang berbeda- beda pula. Ada protein yang mudah larut dalam air, tetepi ada yang sukar larut dalam air. Rambut dan kuku adalah suatu protein yang tidak mudah larut dalam air dan sukar bereaksi, sedangkan protein yang terdapat dalam bagian putih telur mudah larut dalam air dan mudah bereaksi.

Ada empat tingkat stuktur dasar protein, yaitu struktur primer, sekunder, tersier dan kwartener. Dan protein digolongkan dalam golongan besar, yaitu :

1.      Protein sederhana : protein fiber dan protein globular

2.      Protein gabungan : mukoprotein, glikoprotein, lipoprotein dan nucleoprotein

Sifat – sifat protein :

1.      Ionisasi : protein yang larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negatif

2.      Denaturasi : perubahan konformasi alamiah menjadi suatu konformasi yang tidak menentu

3.      Viskositas : suatu larutan protein dalam air mempunyai viskositas atau kekentalan yang relatif lebih besar daripada viskositas air sebagai pelarutnya.

4.      Kristalisasi : sering dilakukan dengan jalan penambahangaram aminosulfat atau NaCl pada larutan dengan pengaturan pH pada titik isolistriknya

5.      Sistem koloid : protein mempunyai molekul besar dan karenanya larutan protein bersifat koloid

Uji kualitatif protein dapan dilakukan dengan berbagai cara, yaitu :

1.      Uji biuret : pembentukan senyawa kompleks koordinat yang berwarna yang dibentuk oleh dengan gugus –CO dan –NH pada ikatan peptide dalam larutan suasana basa

2.      Pengendapan dengan logam : pembentukan senyawa tak larut antara protein dan logam berat

3.      Pengendapan dengan logam : pembentukan senyawa tak larut antara protein dan ammonium sulfat

4.      Pengendapan dengan alkohol : pembentukan senyawa tak larut antara protein dan alkohol

5.      Uji koagulasi : perubahan bentuk yang irevelsibel dari protein akibat dari pengaruh pemanasan

6.      Denaturasi protein : perubahan pada suatu protein akibat dari kondisi lingkungan yang sangat ekstrim

III.            Alat dan bahan

Alat :

1.      Tabung reaksi

2.      Pipet tetes

3.      Gelas ukur

4.      Batang pengaduk

5.      Kertas saring

6.      Stopwatch

7.      Thermometer

Bahan :

1.      NaOh 2,5 N

2.      Larutan protein

3.      Cu 0,01 M

4.      Hg 0,2 M

5.      Timbal asetat 0,2 M

6.      Larutan jenuh (

7.      Reagen millon

8.      Reagen uji biuret

9.      Buffer asetat 5 M

10.  Asam klorida 0,1M

11.  NaOH 0,1 M

12.  Etil alkohol 95%

13.  Larutan albumin

14.  Buffer asetat pH 4,7 (1M)

IV.            Prosedur percobaan dan Data pengamatan

No.	Cara kerja	Pengamatan
1.	Uji biuret 3ml larutan protein Tabung reaksi NaOH 2,5 N aduk 1 tetes larutan Cu ↓ Aduk ↓ Jika tidak timbul warna Tambah 1-2 tetes Cu	Warnanya tetap Albumin : beningungu bening Gelatin : kuning beningtetap
2.	Pengendapan dengan logam 3ml larutan protein ↓ Tabung reaksi ↓ Tambah 5 tetes Hg 0,2 M ↓ Ulangi dengan Pb asetat 0,2 M Lakukan bersamaan	Tabung I : Hg + albumin ( positif terlebih dahulu) Tabung II: Hg + gelatin (tidak ada endapan) Lebih cepat albumin positifnya daripada gelatin
3.	Pengendapan dengan garam Ammonium sulfat ↓+ sedikit sedikit Larutan protein ↓ Aduk sampai Sedikit garam yang tertinngal ↓ Saring larutan jenuh ↓ Uji kelarutan endapan dalam air ↓ Uji juga dengan reagen milon dan filtrate dengan uji biuret	Albumin : setelah ditambahkan ammonium sulfat warnanya menjadi putih, ada endapan Gelatin : setelah ditambahkan ammonium sulfat warnanya menjadi putih dibagian bawah ada endapan,2 fasa Saringan albumin : ada sedikit endapan saat disaring dan warna filtrate menjadi bening Saringan gelatin : ada endapan saat disaring dan warna larutan menjadi bening setelah disaring Endapan albumin + air : larut Endapan albumin + reagen milon : warna merah positif Filtrate albumin + uji biuret : warna ungu Endapan gelatin + air : tidak larut
4.	Pengendapan dengan alkohol tabung 15 ml larutan protein               1 ml buffer asetat pH 4,7                 6 ml etil alkohol  Tabung 2                   Larutan albumin 5 ml              HCl 0,1 M 1 ml             etil alcohol 95% 6 ml tabung 3              larutan albumin 5 ml             NaOH 0,1 M 1 ml             Etil alkohol 95% 6 ml	Tabung 1 : endapan putih tebal diatas dan larutan bening dibawah Tabung 2 : endapan putih sedikit Tabung 3 : tidak ada endapan
5.	Uji koagulasi 5 ml larutan protein ↓ Tabung reaksi ↓ 2 tetes asam asetat 1 M ↓ Letakan di air mendidih 5 menit ↓ Ambil endapan dengan batang pengaduk ↓ Uji kelarutan endapan di air ↓ Uji dengan reagen milon	Albumin : menggumpal Gelatin : tidak ada endapan, tetap Tidak larut Endapan berubah menjadi warna merah
6.	Denaturasi protein Tabung 1 : larutan albumin 9 ml                   HCl 0,1 M Tabung 2 : larutan albumin 9 ml                   NaOH 0,1 1 ml Tabung 3 : larutan albumin                   Buffer asetat pH 4,7 (5 M) 1ml Tabung 1-2-3 ↓dimasukkan Air mendidih 15 menit ↓ Dinginkan pada suhu kamar ↓ Tabung mana ada endapan ? ↓ Tabung 1 dan 2 ↓tambah 10 ml buffer asetat pH 4,7	Bening kuning Bening kuning Bening kuning Tabung 1 : menggumpal,putih, ada yang bening Tabung 2 : tetap, kuning muda bening Tabung 3 : ada endapan, agak kuning Tabung 1 dan 3 Tabung 2 menjadi seperti tabung 1

   V.            Pembahasan

1.      Uji biuret

Pada perrcobaan ini ada kompleks warna ungu, ini adalah pembentukan senyawa kompleks warna ungu yaitu dari –CO dan – NH yang berikatan dengan . Uji ini paling spesifik untuk uji protein dengan menghasilkan warna karena lebih cepat, hasil dapat dilihat langsung dan lebih sensitif.

                                   

2.      Pengendapan dengan logam

Pada percobaan ini campuran HgCl + albumin positif terlebih dahulu ini dikarenakan albumin pH isolistriknya lebih besar daripada gelatin yaitu albumin 4,55-4,90 dan gelatin 4,80-4,85. Karena beberapa protein sangat peka terhadap perubahan lingkungannya.konformasi protein bisa berubah salah satunya dengan logam. Protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan pada suhu 50° C atau lebih. koagulasi ini hanya terjadi apabila larutan protein berada pada titik isolistriknya. Protein yang terdenaturasi pada titik isolistrik masih dapat larut pada pH diluar titik isolistriknya tersebut.

3.      Pengendapan dengan garam

Percobaan ini terkait dengan proses salting in dan salting out. Salting in adalah peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang mempunyai kelarutan lebih kecil dibanding

Zat utamanya yang mempunyai kelarutan lebih kecil dibandingkan zat utamanya sehingga menyebabkan kenaikan kelarutan zat utama. Salting out adalah peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang mempunyai kelarutan lebih besar dibandingkan zat utamanya sehingga menyebabkan penurunan kelarutan zat utama, ini seperti yang terjadi pada larutan protein yang laarutkan garam terus menerus. Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang. Pada uji ini juga dilakukan uji dengan pereaksi milon. Pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah saat pemanasan. Pada dasarnya reaksiini positif untuk fenol- fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil positif.

4.      Pengendapan dengan alkohol

Percobaan ini berkaitan dengan proses denaturasi protein. Protein akan terdenaturasi salah satunya jika direaksikan dengan alkohol serta pH yang asam. Hal ini disebabkan karena menjadi suatu yang tidak menentu merupakan suatu proses yang disebut denaturasi. Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organic akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga kelarutan protein berkurang, dan juga karena alkohol akan berkompetisi dengan protein terhadap air.

5.      Uji koagulasi

Protein dengan penambahan asam atau pemanasan akan terjadi koagulasi. Pada pH iso-elektrik (pH larutan tertentu biasanya berkisar 4 – 4,5 dimana protein mempunyai muatan positif dan negatif sama, sehingga saling menetralkan) kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. Pada temperatur diatas 60°C kelarutan protein akan berkurang (koagulasi) karena pada temperatur yang tinggi energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tersier dan kuartener yang menyebabkan koagulasi.

6.      Denaturasi protein

Denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, Ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipetida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi struktur primer (ikatan peptida) masih utuh. Dalam percobaan ini tabung 2 menjadi seperti tabung 1 karena ditambahkan asam (buffer dan HCl) bentuk stuktur protein berubah dari cair ke padat (mengendap). Protein akan terdenaturasi (menjadi mengendap) jika dalam suasana asam salh satunya.

VI.            Kesimpulan

1.      Uji biuret biasa digunakan untuk menguji protein karena lebih spesifik

2.      Logam dapat mengendapkan protein, sehinnga digunakan dalam pengobatan keracunan merkuri

3.      Protein dapat larut dalam basa sehinnga protein tidak terdenaturasi

4.      Asam dapat menyebabkan protein terdenaturasi (menggumpal)

5.      Denaturasi protein bias disebabkan oleh cuaca ekstrim, suhu tinggi dan pH asam, pelarut organic

VII.            Daftar pustaka

1.      Syamsuni H.A. Apt. Drs. ; ilmu resep ; penerbit buku kedokteran : EGC ; Jakarta

2.      Poedjiadi Anna Prof. Dr. ; Dasar – dasar biokimia ; UIP ; Jakarta

3.      http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3617/1/farmasi-mtsim2.pdf

dapat diakses pada hari senin tanggal 8 november 2010 pukul 22.05